Larry Daley (Stiller) gelooft, ondanks zijn tot op heden ongelukkige leven, dat er iets groots voor hem staat te gebeuren.
Dat blijkt wel als hij aangenomen wordt als nachtwaker bij het "Museum of Natural History".
Tijdens zijn diensten beginnen er vreemde dingen te gebeuren. Gladiatoren en cowboys voeren een nachtelijke strijd terwijl een Neanderthaler zijn eigen display verbrandt, en de T-rex iedereen laat zien waarom hij het meest gevreesde roofdier is uit de geschiedenis.
In al deze chaos kan Larry zich maar tot één persoon richten. Een wassenbeeld van president Teddy Roosevelt (Williams) dat hem moet helpen deze chaos te stoppen en zo het museum te redden.
Hierbij wordt hij opgehouden door het aapje Dexter en een rondrennende T-Rex...